Skip to content

Wykrywanie mutacji w genie tyrozynazy u pacjenta z typem IA cystykołaczykowym bielactwo ad

2 miesiące ago

436 words

Startery dla egzonu (5 -GCTCCTGGCTGTTTTGTACT-3 / 5 -CTGCCAAGAGGAGAAGATG-3 ), ekson 2 (5 -ATTGTCTGTAGCCGATTGGA – 3 / 5 -CTTCCAGTGTATTTCTAAAG-3 ), ekson 3 (5 -GATTTGCTAGTCCACTTACT -3 / 5 -CTGTCAACAAATGCATGGTG-3 ) i ekson 5 (5 -ACCCAGACTCTTTTCAAGAC – 3 / 5 -TAAGAGCACTTTAATTCAC-3 ) pochodziły z pierwszej i ostatniej 19 lub 20 zasad odpowiednich eksonów8 9 10 ; w związku z tym sekwencji egzonowych odpowiadających starterom nie można było określić w probandzie. Startery dla eksonu 4 pochodziły z sąsiednich sekwencji interweniujących (5 -ACAATATGTTTCTTAGTCTG – 3 / 5 -TGGTAACACTAGATTCAGC-3 , dane niepublikowane), a zatem amplifikowały kompletny ekson, jak również sąsiednie regiony łączące splicing. Czterdzieści cykli amplifikacji reakcji łańcuchowej polimerazy przeprowadzono za pomocą zautomatyzowanego termocyklera DNA (DNAStar, Madison, Wis.). Każdy cykl obejmował jedną minutę w 92 ° C w celu denaturacji dwuniciowego DNA i dwie minuty w 48 ° C dla starterów do przyłączenia się do ich komplementarnych sekwencji i do przedłużenia nici DNA. Po amplifikacji DNA produkty reakcji oczyszczono za pomocą elektroforezy w 1,5% żelu agarozowym i wyizolowano za pomocą GeneClean (Bio101, La Jolla, CA). Kompletne sekwencje DNA oczyszczonych dwuniciowych produktów reakcji łańcuchowej polimerazy określono na obu niciach, zasadniczo za pomocą metody Sangera i innych metod zakończenia łańcucha dideoksy19. Wszystkie sekwencje określono co najmniej dwa razy, z produktami co najmniej dwie niezależne reakcje łańcuchowe polimerazy. Hybrydyzacje oligonukleotydów swoistych dla alleli
Hybrydyzacje oligonukleotydów swoistych dla allelu przeprowadzono zasadniczo jak opisano gdzie indziej, 20 za pomocą sond oligonukleotydowych 19-merowych znakowanych 5 -końcowymi znakowanymi radioaktywnie, odpowiadających normalnym (5 -TATGAATGGAACAATGTCC-3 ) i mutantowi (5 -TATGAATGGAAAAATGTCC-3). formy kodonu 355 i normalne (5 -GATCTGCCAACGATCCTAT-3 ) i zmutowane (5 -GATCTGCCAACAATCCTAT-3 ) formy kodonu 365. Fragmenty egzonu 3 zostały zamplifikowane przez łańcuchową reakcję polimerazy, jak opisano powyżej, i 20 .l każdego produktu reakcji (5 .l) naniesiono na membrany nylonowe MAGNA (Micron Separations, Richmond, CA) za pomocą urządzenia do mikrofiltracji Bio-Dot SF (Bio-Rad, Westborough, Mass.). Filtry replikacyjne prehybrydyzowano, hybrydyzowano z każdą sondą przez jedną godzinę w 55 ° C i płukano dokładnie tak, jak opisano gdzie indziej20 przed autoradiografią.
Wyniki
Rycina 1. Rycina 1. Analiza sprzężenia negatywy tyrozynazy z bieleniem tylnym i genu tyrozynazy. Strzałka Wskazuje pacjenta badania. Stałe symbole oznaczają osoby z albinizmem oczno-skórnym typu IA; półdłabe symbole osób heterozygotycznych dla stanu; otwarte symbole normalne osoby; otwarte symbole z kropkami osób, których zygotyczność nie została określona; i symbole półotwartych osób uważanych za heterozygotyczne. Koła oznaczają kobiety, kwadraty mężczyzn i diamenty przodków nieprzypisanej płci. Pokazano genotypy TaqI tyrozynazy 2,8 kb i 2,4 kb.
Analiza genetycznych powiązań w badanych rodzinach wykazała, że występowanie albinizmu okołowinowego typu IA w probandzie i jej siostrach wynikało z defektów w genie lub w pobliżu genu tyrozynazy
[przypisy: kikut krukenberga, zwiotczenie przepony, kryształki kwasu moczowego w moczu ]

0 thoughts on “Wykrywanie mutacji w genie tyrozynazy u pacjenta z typem IA cystykołaczykowym bielactwo ad”