Skip to content

Ciężki złożony niedobór odporności ze względu na specyficzny defekt w produkcji interleukiny-2 cd

2 miesiące ago

398 words

Jako drugie przeciwciało użyto oczyszczonej przez powinowactwo kojarzonej z fluoresceiną koziej immunoglobuli- ny (Cappel Laboratories, Malvern, Pa.). Zabarwione komórki analizowano w sorterze komórek EPICS-V (Coulter) i analizowano 10 000 komórek bramkowanych na próbkę. Zastosowano logarytmiczną skalę intensywności fluorescencji, a komórki, których intensywność przekroczyła górną granicę wartości dla kontroli negatywnej, uznano za pozytywne. Proliferacja limfocytów
Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej zawieszono ponownie w pożywce RPMI 1640 z 10% ludzką surowicą (krew typu A, Rh dodatni) przy 5 x 105 komórek na mililitr; 100 000 komórek (0,2 ml) dodano do 96-studzienkowych płytek do mikromiareczkowania. Fitohemaglutyninę (Difco, Detroit) dodano w rozcieńczeniu 1: 250, 1: 1250 lub 1: 6250. Proliferację mierzono jako inkorporację [3H] tymidyny przez hodowle po 16-godzinnej pulsacyjnej inkubacji z .Ci [3H] tymidyny na studzienkę. Eksperymenty przeprowadzono trzykrotnie.
Zastosowano dwa źródła egzogennej interleukiny-2. Początkowo supernatanty z linii białaczki limfocytów T gibona MLA 144, które wytwarzają interleukinę-2, dodano w końcowym stężeniu 10 procent (obj./obj.) 13. W późniejszych eksperymentach zastosowano rekombinowaną ludzką interleukinę-2 (Cetus, Emeryville, Calif .) w stężeniach od 6 do 60 IU na mililitr. Oczyszczoną interleukinę-1 (Cistron, Pine Brook, NJ) dodano w stężeniach do 10 U na mililitr. W niektórych eksperymentach limfocyty stymulowano octanem mirystynianu forbolu (20 ng na mililitr) i jonoforem wapnia A23187 (0,3 umol na litr, Calbiochem, San Diego).
Testy interleukiny-2
Wytwarzanie funkcjonalnej interleukiny-2 wykryto przez proliferację zależnej od interleukiny 2 mysiej linii komórkowej CTLL-2.14 A w sumie 10 000 komórek CTLL w pożywce RPMI 1640 zawierającej 10% surowicy płodowej cielęcej (0,2 ml) i 2-merkaptoetanolu. (50 .moli na litr) dodano do 96-studzienkowych płytek. Limfocyty krwi obwodowej pacjenta (500 000 na mililitr) hodowano przez 48 godzin w pożywce RPMI 1640 zawierającej 10% ludzkiej surowicy A + i fitohemaglutyninę (rozcieńczenie 1: 1250). Szeregowe rozcieńczenia supernatantów z hodowli limfocytów pacjenta dodano do komórek CTLL. Proliferację komórek CTLL w odpowiedzi na interleukinę-2 mierzono przez inkorporację [3H] tymidyny po 24 godzinach. Rekombinowaną ludzką interleukinę-2 zastosowano jako standard do ilościowego oznaczenia ilości obecnego interleukiny-2.
Analiza RNA
Cytronowe matrycowe RNA (mRNA) mierzono za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy z użyciem starterów i sond specyficznych dla transkryptów interleukiny-2 i interferonu gamma. RNA wyizolowano metodą izotioocyjanianokwasową z kwasem guanidynowym.15 RNA inkubowano następnie ze starterami dla interleukiny-2 lub interferonu gamma w 50 .l buforu reakcyjnego zawierającego 10 mM chlorowodorek TRIS (pH 7,3), 50 mM potasu. chlorek, 2,5 mM chlorek magnezu, 0,01% żelatyny, 500 .M każdego deoksynukleotydu (trifosforan deoksyadenozyny, trifosforan deoksycytydyny, trifosforan deoksyguanozyny i trifosforan deoksytymidyny) i 50 pM każdego startera oligonukleotydowego
[hasła pokrewne: kryształki kwasu moczowego w moczu, olx chojnów, kikut krukenberga ]

0 thoughts on “Ciężki złożony niedobór odporności ze względu na specyficzny defekt w produkcji interleukiny-2 cd”

  1. [..] odnosnik do informacji w naukowej publikacji odnosnie: sprzedaż włosów naturalnych[…]